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  • PCR體系中引物占有十分重要的地位
  • 2019-9-6 9:03:59
  • 在整個PCR體系中,引物占有十分重要的地位。PCR的特異性要求引物與靶DNA特異結合,不與其他非目的的DNA結合,PCR的靈敏性要求DNA聚合酶能與引物進行有效的延伸,可見引物設計好壞與PCR結果密切相關。

     

    一、PCR引物設計原則

     

    1、引物長度一般在15-30bp

    引物長度一般為15-30bp,常用的為18-27bp,但不應大于38bp,因為過長會導致其延伸溫度大于74℃,不適于Taq DNA聚合酶進行反應;

     

    2、引物GC含量一般為40%-60%

    引物GC含量一般為40%-60%,以45-55%為宜,GC含量過高或過低都不利于引發反應。上下游引物GC含量和Tm值要保持接近;

     

    3、引物所對應的模板序列的Tm值最好在72℃左右

    Tm值在72℃左右可使復性條件最佳,至少要在55-80℃之間。Tm值的計算有多種方法,如按公式Tm=4(G+C)+2(A+T),在Oligo軟件中使用的是最鄰近法(the nearest neighbor method);

     

    4、引物3’端的堿基一般不用A

    引物3’端的堿基一般不用A,因為A在錯誤引發位點的引發效率相對比較高。

    5、引物3’端出現3個以上的連續堿基,如GGG或CCC,也會使錯誤引發機率增加。

     

    6、引物3’端的互補、二聚體或發夾結構也可能導致PCR反應失敗。

     

    7、如擴增編碼區域,引物3’端不要終止于密碼子的第3位,因密碼子的第三位易發生簡并,會影響擴增特異性與效率;

     

    8、引物5’端可以修飾

    引物5’端序列對PCR影響不太大,因此常用來引進修飾位點或標記物。

     

    9、堿基要隨機分布,且引物自身和引物之間不能有連續4個堿基的互補。

    引物序列在模板內應當沒有相似性較高,尤其是3’端相似性較高的序列,否則容易導致錯誤引發。降低引物與模板相似性的一種方法是,引物中四種堿基的分布最好是隨機的,不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。引物自身不應存在互補序列,否則引物自身會折疊成發夾結構(Hairpin)使引物本身復性。這種二級結構會因空間位阻而影響引物與模板的復性結合。引物自身不能有連續4個堿基的互補。兩引物之間也不應具有互補性,尤其應避免3’端的互補重疊以防止引物二聚體(Dimer與Cross Dimer)的形成。引物之間不能有連續4個堿基的互補。引物二聚體及發夾結構如果不可避免的話,應盡量使其△G值不要過高(應小于4.5kcal/mol)。否則易導致引物二聚體帶的 產生,并且降低引物有效濃度而使PCR反應不能正常進行。

     

    10、引物的ΔG值最好呈正弦曲線形狀,即3’端ΔG值較低,而5’端和中間ΔG值相對較高。

    ΔG值(自由能)反應了引物與模板結合的強弱程度,一般情況下,引物的ΔG值最好呈正弦曲線形狀,即3’端ΔG值較低,而5’端和中間ΔG值相對較高。3'端的ΔG值相對要低,且絕對值不要超過9,引物的3’端的ΔG值過高,容易在錯配位點形成雙鏈結構并引發DNA聚合反應。

     

    11、引物應在核酸保守區內設計并具有特異性。引物與非特異擴增序列的同源性不要超過70%或有連續8個互補堿基同源。

     

    二、Real Time PCR引物設計原則

     

    Real Time PCR用引物與普通PCR引物設計要求不同。RealTime PCR是讓目的基因按照理論值進行擴增,對非特異性反應和引物二聚體要求嚴格。

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