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  • 輕松看懂pcr實驗結果圖
  • 2019-10-25 10:57:17
  • 辛辛苦苦提完 RNA,逆轉錄后一個個孔加完引物和模板,Z后進行 RT-PCR,你以為這樣就可以美滋滋地坐等結果了?等到一幅下面這樣的結果圖,不知道對于剛接觸 RT-PCR 的你來說內心是否是崩潰的?

    這是啥?怎么看?

    別急,讓我慢慢跟你介紹,看完后你就能準確的分析出你的 RT-PCR 結果了?!高@里以 7500 軟件為例進行介紹」

    1. 首先設置好內參和對照組「在 Analysis Settings 處」,一般我們在上機前會對應設置好的,如果設置好的話可以直接跳至第 3 點。如果沒有設置好的話是需要重新進行設置。

    2. 點擊進去后,選擇對應好的內參和對照組?!冈?Relative Quantization Settings 選項下」

    3.選擇好內參和對照組后,我們首先看看 PCR 跑的有沒有問題,在這里大家Z常會見到的問題是在樣品池出現了三角形符號,如下圖:

    那么這些三角形代表什么意思?沒錯,聰明的你應該已經想到是這個孔出現了問題,而三角形中的數字是幾則代表了孔中有幾個問題。具體又是什么問題呢?我們就要通過 analysis 中的 QC Summery 進行查找。

    舉個栗子,比如圖中的 A9 孔,出現了 2,則表示有 2 個問題,第 1 個問題如上圖所示,High standard deviation 高的標準偏差,表示可能是你上樣時導致的樣品復孔之間差異較大。第二個問題則是下圖中,系統認定 A9 孔中的數值偏差較大,屬于異常值。

    當然,還有比較常見的問題是引物二聚體引起的雙重峰,如 A4 孔。

    4. 溶解曲線「melt curve」:表示隨溫度升高 DNA 的雙螺旋結構降解程度的曲線??偟?DNA 雙螺旋結構降解一半的溫度稱為熔解溫度「Tm」,不同序列的 DNA,Tm 值不同。DNA 中 G-C 含量越高,Tm 值越高,成正比關系。正如上面提到的,正常的樣品孔溶解曲線應該是單峰的,如下圖。如果出現了雙峰,則要考慮是否引物設計不合理或者引物過量引起溶解曲線出現多峰的情況。

    5. 如果前面的幾項都沒有太大的問題的話。Z后我們看看Z重要的結果,也就是目的基因的變化情況了。在內參與對照組選擇沒錯的情況下,點擊 gene expression 選項,選中你想查看的樣品孔的基因表達情況。

    好了,這次的 RT-PCR 看圖分析就到這里。Z后需要注意的是圖中的結果還需要輸出進行后續的自行運算得出結果。圖中的結果只能給出參考。但大致趨勢是相同的,如果還有童鞋想聽后續如何計算 RT-PCR 的結果及原理的話,歡迎關注下期的 RT-PCR 結果的計算原理與計算模板。


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